一、样本采集与预处理

‌样本类型‌

‌环境样本‌：土壤、水体、谷物等需无菌采集，优先选择污染或霉变区域‌。

‌生物样本‌：动物组织（如肠道内容物）、植物病斑组织需低温保存运输，防止菌株失活‌。

‌前处理流程‌

‌富集培养‌：使用选择性培养基（如PDA培养基）分离目标真菌，25–28℃培养3–7天，观察菌落形态‌。

‌毒素辅助筛查‌：对疑似产毒菌株（如镰刀菌属），同步检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）等毒素，采用ELISA法快速初筛‌。

二、菌株鉴定方法

‌形态学鉴定‌

‌菌丝与孢子特征‌：显微镜观察菌丝分枝、隔膜及孢子形态（如镰刀菌的镰刀形分生孢子）‌。

‌菌落特征‌：记录菌落颜色（白色→粉红→紫色）、边缘形态及生长速度，辅助区分镰刀菌、曲霉等属‌。

‌分子生物学鉴定‌

‌ITS序列分析‌：扩增真菌ITS1/ITS4区域，测序比对NCBI数据库，鉴定至种水平（如Fusarium graminearum）‌67。

‌多重PCR检测‌：针对特定毒素合成基因（如Tri5基因簇）设计引物，验证产毒能力‌。

三、功能与毒性评估

‌产毒能力检测‌

‌HPLC/UPLC法‌：定量分析DON等毒素，Agilent ZORBAX C18色谱柱分离，检测限达0.1 μg/kg‌78。

‌细胞毒性实验‌：通过红细胞溶血试验或Caco-2细胞模型评估毒素对肠道屏障的破坏效应‌。

‌耐药性分析‌

‌抗生素敏感性测试‌：采用微量肉汤稀释法测定菌株对临床抗生素（如万古霉素、达托霉素）的MIC值‌。

‌耐药基因检测‌：宏基因组测序结合qPCR技术，分析耐药基因（如vanA、liaR）的丰度与表达水平‌。

四、检测流程标准化

‌步骤‌            ‌           方法‌                 ‌              适用标准‌

样本前处理    无菌采集+富集培养          ISO 21527-1:2008‌

毒素筛查     ELISA法/免疫亲和柱净化     GB 5009.111-2016‌

分子鉴定         ITS测序+多重PCR            AOAC 2013.07‌

毒性验证     细胞毒性实验+HPLC定量    GB 31660.5-2021‌

五、质量控制要点

‌交叉污染防控‌

实验分区操作（样本处理区、PCR区、测序区），紫外线灭菌30分钟/次‌。

阴性对照设置：使用无菌水替代样本，排除试剂污染‌。

‌数据验证‌

毒素检测需加标回收实验（回收率85–110%），HPLC峰面积RSD≤5%‌。

测序结果需双向验证，序列相似度≥99%判定为同种‌。

六、技术发展趋势

‌快速检测‌：开发便携式LAMP试剂盒，30分钟内完成镰刀菌属特异性检测‌。

‌多组学整合‌：结合代谢组学分析毒素合成通路，预测菌株致病潜力‌。